Redigeret af Peter Sarnow, Stanford University School of Medicine, Stanford University, Californien, godkendt den 25. december 2020 (gennemgået den 25. oktober 2020)
Vi rapporterer interaktionen mellem underenheder i replikationen af coronavirus-transkriptionskomplekser, som er essentielle for replikation og evolutionær konservering.Vi leverede bevis for, at NiRAN-domænet associeret med nsp12 har nukleosidmonophosphat (NMP)-transferaseaktivitet i trans og identificerede nsp9 (et RNA-bindende protein) som dets mål.NiRAN katalyserer den kovalente binding af NMP-delen til den konserverede nsp9-aminoterminal i en reaktion, der er afhængig af Mn2+-ioner og tilstødende konserverede Asn-rester.Det blev fundet, at NiRAN-aktivitet og nsp9 NMPylering er afgørende for replikation af coronavirus.Dataene giver os mulighed for at koble denne aktivitet af den indlejrede virusenzymmarkør til de tidligere observationer i hypotesen om, at initieringen af RNA-syntese i en klasse af RNA-vira er funktionelt og evolutionært konsistent.
Den RNA-afhængige RNA-polymerase (RdRps) fra Nidovirales (Coronaviridae, Arterioviridae og 12 andre familier) er knyttet til det aminoterminale (N-terminale) domæne i det ikke-strukturelle protein (nsp) frigivet fra polyproteinet, kaldet NiRAN 1ab er sammensat af viral hovedprotease (Mpro).Tidligere blev den arterielle virus NiRAN-RdRp nsp's egen GMPylerings/UMPyleringsaktivitet rapporteret, og det blev foreslået at generere en forbigående for overførsel af nukleosidmonophosphat (NMP) til (i øjeblikket ukendt) virus og/eller cellebiopolymerisation.Her viser vi, at coronavirus (Human Coronavirus [HCoV]-229E og Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2) nsp12 (NiRAN-RdRp) har Mn2+-afhængig NMPyleringsaktivitet, som er afledt af nsp9 gennem dannelsen af Mpro-medieret nsp9 efter den N-terminale flankerende nsps frigives proteolytisk, phosphoramidatet er bundet til den primære amin (N3825) ved N-terminalen af nsp9.Uridintriphosphat er det foretrukne nukleotid i denne reaktion, men adenosintriphosphat, guanosintriphosphat og cytidintriphosphat er også egnede co-substrater.Mutationsundersøgelser under anvendelse af rekombinante coronavirus nsp9- og nsp12-proteiner og gensplejsede HCoV-229E-mutanter bestemte resterne, der var nødvendige for NiRAN-medieret nsp9-NMPylering og virusreplikation i cellekultur.Dataene bekræftede forudsigelsen af NiRAN-rester af det aktive sted og bestemte den vigtige rolle af nsp9 N3826-rester i nsp9 NMPylering og virusreplikation in vitro.Denne rest er en del af den konserverede N-terminale NNE-tripeptidsekvens og viste sig at være den eneste invariante rest af nsp9 og dens homologer i coronavirus-familien.Denne undersøgelse giver et solidt grundlag for den funktionelle undersøgelse af NMPyleringsaktivitet af andre indlejrede vira og foreslår mulige mål for udvikling af antivirale lægemidler.
Nidovirales positivt-strenget RNA-virus inficerer en række hvirveldyr og hvirvelløse dyr (1, 2).Ordren omfatter i øjeblikket 14 familier (3), hvoraf Coronavirus-familien er blevet grundigt undersøgt i de sidste 20 år.På det tidspunkt dukkede tre zoonotiske coronavirus op fra dyreværter og forårsagede storstilede udbrud af alvorlige luftvejsinfektioner hos mennesker.Herunder vedvarende pandemier forårsaget af alvorlige akutte infektionssygdomme.Respiratorisk syndrom Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) (4ââââ7).Nidovira deler en fælles genomorganisation, og underenheden af det membranbundne replikations-transkriptionskompleks (RTC) er kodet i de 5-?²-terminale to-tredjedele og den vigtigste strukturelle underenhed af viruspartiklen, såvel som noget tilbehør .Protein, kodet i den 3??² ende tredjedel af genomet (1).Bortset fra én familie af planære vira (Monoviridae) (8), koder alle indlejrede vira for RTC-underenheder i to store åbne læserammer (ORF) ORF1a og ORF1b, som er translateret fra genomisk RNA af.ORF1a koder for polyprotein (pp) 1a, og ORF1a og ORF1b koder i fællesskab for pp1ab.Med den generelle deltagelse af hovedproteasen (Mpro) kodet af ORF1a, bliver både pp1a og pp1ab proteolytisk bearbejdet til en række ikke-strukturelle proteiner (nsps), også kendt som 3CLpro, fordi det har homologi med 3Cpro af picornaviruset ( 9).Disse nsp'er menes at være samlet i en stor dynamisk RTC, katalysere syntesen af genomisk RNA (replikation) og et sæt af subgenomisk RNA (transkription) og bruges til at koordinere ekspressionen af ORF'en placeret nedstrøms for ORF1b (10? ? ?12).
Kerne-RTC omfatter RNA-afhængig RNA-polymerase (RdRp) (13), superfamilie 1 helicase (HEL1) (14, 15) og adskillige RNA-processenzymer, som hovedsageligt er kodet i ORF1b og i coronavirus-familien. Den indeholder nsp12-nsp16 og nsp9-nsp12 i Arterioviridae-familien (se reference 10ââ 12).RdRp og HEL1 repræsenterer to (en femtedel) konserverede domæner af fuglerede virus og har homologi blandt andre RNA-vira.Kernereplikase menes at blive assisteret af andre underenheder, herunder adskillige små nsp'er frigivet fra den carboxyterminale (C-terminale) region af pp1a, nedstrøms for Mpro (henholdsvis coronavirus nsp5 og arteriel virus nsp4).De har begrænset familiespecifik beskyttelse og forskellige aktiviteter (gennemgået i reference 10ââ12).
Relativt for nylig blev et domæne med unikke sekvensmotivkarakteristika fundet ved aminoterminalen (N-terminus) ved siden af RdRp i alle indlejrede vira, men ingen andre RNA-vira (16).Baseret på dets placering og nukleotidtransferase (nukleosidmonofosfat [NMP] transferase) aktivitet, er dette domæne navngivet NiRAN (Nestvirus RdRp-relateret nukleotidtransferase).Dual-domæne-kombinationen af NiRAN-RdRp udgør nsp12 i Coronaviridae-familien og nsp9 i Arterioviridae-familien, og i andre nestoviridae forventes NiRAN-RdRp at blive frigivet som en uafhængig nsp fra det virale polyprotein.I coronavirus indeholder NiRAN-domænet ??1/450 rester og er forbundet til det C-terminale RdRp-domæne gennem linkerregionen (16?19).I Equine Arteritis Virus (EAV) (Arteriviridae) viser rekombinant nsp9 Mn2+ ionafhængige (selv) UMPylerings- og GMPyleringsaktiviteter, som afhænger af tre konserverede sekvensbaser i nestovirus, AN, BN og CN. Resterne i sekvensen.Hvor N står for NiRAN) (16).Den N-terminale flankering af disse motiver er et mindre konservativt motiv preAN.Nogle af disse rester er også konserveret i fjernt beslægtede proteinkinaser, hvor de har vist sig at være involveret i nukleosidtriphosphat (NTP) binding og katalytisk aktivitet (20, 21).I overensstemmelse med denne observation kan flere nøgleaktive steder i pseudokinase SelO fra Pseudomonas syringae samles med det nyligt offentliggjorte SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13 superkompleks.Bevarede Coronavirus NiRAN-rester overlejret i elektronmikrostrukturen.Rekombinant protein (17).Det spekuleres i, at den dokumenterede (selv) U/GMPylering vil producere en forbigående tilstand til at overføre NMP til det (p.t. ukendte) substrat (16), og den strukturelle lighed mellem NiRAN og proteinkinase (17, 19) ) Er hypotesen, at NiRAN modificerer andre proteiner.
Mange funktioner, herunder dens unikke og unikke systematiske forbindelse med indlejrede vira og genetisk adskillelse fra RdRp, gør NiRAN til et rimeligt nøgleregulatorisk enzym for indlejrede vira, hvilket er afgørende for deres fremkomst og identitet.Tidligere blev tre mulige funktioner, der involverede NiRAN til at regulere genom/subgenomisk translation eller replikation/transkription, kaldt.Når man betragter de knappe og ufuldstændige data, der er tilgængelige på det tidspunkt, har hver funktion sine fordele og ulemper (16).I denne forskning sigter vi mod at kombinere de biokemiske og omvendt genetiske undersøgelser af coronavirussen, der repræsenterer de to slægter, og sætte vores resultater i den evolutionære baggrund af den naturlige mutation af coronavirus-familien, for at få indsigt i dette mystiske rige.Vi rapporterer store fremskridt i forståelsen af NiRAN gennem identifikation af naturlige mål i RTC, som (blandt de tre tilgængelige hypoteser) bidrager til rollen for dette domæne i initiering af syntesen af indlejret virus-RNA.Denne forskning åbner også muligheder for andre roller af NiRAN på virusværtsgrænsefladen.
For at karakterisere de enzymatiske egenskaber af det coronavirus nsp12-relaterede NiRAN-domæne, producerede vi en rekombinant form af humant coronavirus 229E (HCoV-229E) nsp12 i E. coli, med et His6-mærke ved C-terminalen, og kombinerede protein med [α32-P ] Inkuber sammen med NTP i nærvær af MnCl2 som beskrevet i Materialer og metoder.Analysen af reaktionsproduktet indikerede tilstedeværelsen af et radiomærket protein, der migrerer sammen med nsp12 (106 kDa), hvilket indikerer, at coronavirus nsp12 katalyserer dannelsen af kovalente protein-NMP-addukter, fortrinsvis dannet med uridinmonophosphat (UMP) (figur 1A) og B).Kvantitativ analyse viste, at sammenlignet med andre nukleotider steg signalintensiteten af UMP-inkorporering med 2 til 3 gange (figur 1C).Disse data er i overensstemmelse med den forudsagte NMP-transferaseaktivitet af NiRAN-domænet af coronavirus (16), men indikerer, at nukleotidpræferencerne for NiRAN-domænet af coronavirus og den arterielle virus er forskellige.
Selv-NMPyleringsaktivitet af HCoV-229E nsp12.(A) HCoV-229E nsp12-His6 (106 kDa) blev inkuberet med det betegnede [α-32P] NTP i nærvær af 6 mM MnCl2 i 30 minutter (se materialer og metoder for detaljer).Reaktionsprodukterne blev adskilt ved SDS-PAGE og farvet med Coomassie brilliant blue.(B) Det radiomærkede protein visualiseres ved phosphor-billeddannelse.Positionerne af nsp12-His6 og proteinmolekylmassemarkører (i kilodalton) er vist i A og B. (C) Intensiteten af det radioaktive signal (middel ± SEM) blev bestemt ud fra tre uafhængige eksperimenter.*P≤0,05.Signalstyrken (procent) er relateret til UTP.
Selvom NiRAN-relaterede enzymaktiviteter har vist sig at være essentielle for replikation af EAV og SARS-CoV i cellekultur (16), er den specifikke NiRAN-funktion og potentielle mål endnu ikke blevet bestemt.Den nyligt rapporterede strukturelle lighed mellem NiRAN og en familie af proteiner med proteinkinase-lignende folder (17, 22) fik os til at teste hypotesen om, at NiRAN katalyserer NMPyleringen af andre proteiner.Vi genererede et sæt potentielle homologe mål, inklusive ikke-strukturelle proteiner kodet af HCoV-229E ORF1a (nsps 5, 7, 8, 9, 10), som hver indeholdt et C-terminalt His6-tag (SI-tillæg, tabel S1), og inkuber disse proteiner med [α32-P] uridintriphosphat ([α32-P]UTP) i nærvær eller fravær af nsp12.Bovint serumalbumin og MBP-LacZa-fusionsprotein produceret i E. coli tjente som kontroller (figur 2A, bane 1 til 7).Det radioaktivt mærkede protein blev analyseret ved natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) og autoradiografi, og det blev fundet, at der var et stærkt radioaktivt signal i reaktionen indeholdende nsp12 og nsp9.Positionen af signalet svarer til molekylmassen af nsp9, hvilket indikerer nsp12-medieret UMPylering af nsp9 (figur 2B, spor 7).Ingen andre testproteiner blev fundet at være UMPylerede, hvilket fik os til at konkludere, at nsp9 er et specifikt substrat for nsp12.I overensstemmelse med selv-NMPyleringsdataene vist i figur 1 er nsp12 i stand til at overføre alle fire NMP'er til nsp9, selvom effektiviteten er forskellig, UMP> adenosinmonofosfat (AMP)> guanosinmonofosfat (GMP)> cytidinmonofosfat (CMP) ) ( Billede).3A og B).Under de betingelser, der blev brugt i dette assay (forkort reaktions- og eksponeringstiden, reducer koncentrationen af nsp12; materialer og metoder), kunne selv-NMPyleringen af nsp12 ikke påvises (sammenlign figur 2B, bane 7 og figur 1B), hvilket viste sig at være en effektiv (Og flere runder) UMP flyttede fra nsp12 til nsp9.UMP-transferaseaktivitet kræver tilstedeværelse af Mn2+-ioner, som vist i figur 3C, mens kun minimal UMP-transferaseaktivitet blev observeret i nærvær af Mg2+, og ingen aktivitet i nærværelse af de to andre testede divalente kationer.Lignende data blev opnået i NMPyleringsassays indeholdende cytidintriphosphat (CTP), guanosintriphosphat (GTP) og adenosintriphosphat (ATP) (SI tillæg, figur S1).
HCoV-229E nsp12-medieret UMPylering af nsp9.En række proteinsubstrater (herunder bovint serumalbumin, MBP-lacZα og en række HCoV-229E nsps mærket med C-terminal His6 kodet af ORF1a) blev brugt til at evaluere UMPyleringsaktiviteten af HCoV-229E nsp12-His6⁺-medieret protein.Inkuber proteinet med [α-32P] UTP i 10 minutter i fravær (A) eller tilstedeværelse (B) af nsp12 som beskrevet i materialerne og metoderne.Øverst i A og B er vist SDS-polyacrylamidgel farvet med Coomassie Brilliant Blue, og i bunden af A og B er de tilsvarende autoradiogrammer vist.Positionen af proteinmolekylmassemarkøren (i kilodalton) er angivet til venstre.Positionen af nsp12-His6 (B, øverst) og det radioaktive signal observeret under inkubationen af nsp12-His6 med nsp9-His6 (B, bane 7) er også angivet, hvilket indikerer, at [α-32P]UMP til nsp9-His6 (12,9 kDa), hvilket ikke blev observeret for andre testede proteiner.
HCoV-229E NiRAN-medieret biokemisk og virologisk karakterisering af nsp9 NMPylering.(A og B) Rollen af nukleotid-co-substratet anvendt i reaktionen.Nsp12-His6 og nsp9-His6 blandes og inkuberes i nærvær af forskellige [α-32P] NTP'er i standard NMPyleringsassayet.(A, øverst) Coomassie-farvet nsp9-His6 adskilt af SDS-PAGE.(A, nederst) Autoradiograf af det samme område af gelen.(B) Den relative aktivitet (gennemsnit ± SEM) i nærvær af den udpegede nukleotid-cofaktor bestemmes ud fra tre uafhængige eksperimenter.*P≤0,05.(C) Metalioners rolle.Vist er standard NMPyleringstesten i nærvær af [α-32P] UTP og forskellige metalioner, hver med en koncentration på 1 mM.I C vises den øverste, Coomassie-farvede nsp9-His6, og i C, den nederste, vises den tilsvarende autoradiografi.Størrelsen af det mærkede protein (i kilodalton) er vist til venstre for A og C. (D) Den mutante form af HCoV-229E nsp12-His6, der bærer den specificerede aminosyresubstitution, er i [α-32P]UTP, som beskrevet i materialer og metoder.Det radiomærkede nsp9-His6 produceret i NMPyleringsreaktionen detekteres ved phosphoryleringsbilleddannelse (D, øverst).Den relative aktivitet sammenlignet med vildtype (wt) proteinet er vist i D, og bunden er taget som gennemsnittet (±SEM) fra tre uafhængige forsøg.Stjerner indikerer substitutioner af ikke-konserverede rester.(E) Virustiteren i kultursupernatanten af p1-celler opnået 24 timer efter infektion blev bestemt ved plakassay.Kodonsubstitutionerne i NiRAN-domænet af den konstruerede HCoV-229E-mutant er angivet (restnummerering er baseret på deres position i pp1ab).Den replikationsdeficiente RdRp-aktive site-mutant nsp12_DD4823/4AA blev brugt som kontrol.
For at få en dybere forståelse af det aktive sted af NiRAN og bestemme resterne relateret til aktiviteten af nsp9-specifik NMP-transferase, udførte vi mutationsanalyse, hvor vi erstattede de konservative rester i NiRAN AN-, BN- og CN-motiverne ( 16) Det er Ala (SI appendiks, figur S2).Derudover blev virkningen af konservative Arg-til-Lys- eller Lys-til-Arg-substitutioner evalueret i to tilfælde.Som en (negativ) kontrol erstattes rester, der ikke eller mindre er konserverede i NiRAN-domænet af coronavirus og andre indlejrede vira, med Ala. Erstatter K4116A (i motiv preAN), K4135A (AN), R4178A (BN), D4188A (motiv BN) og D4280A (CN) reducerer eller endda eliminerer nsp9 NMPylering gennem nsp12, mens proteiner med konservative substitutioner (R4178K), K4116R) bevarer 60% og 80% af deres aktivitet, hvilket indikerer, at lempelsen af restriktionerne på deres respektive side kæder er fysisk-kemisk følsomme (figur 3D).Udskiftning af flere andre konserverede rester E4145A, D4273A, F4281A og D4283A er meget mindre skadeligt, og nsp9 UMPylering er kun moderat reduceret.Lignende resultater blev opnået i nsp9 NMPyleringsreaktioner, der involverer andre NTP'er (figur 3D og SI-tillæg, figur S3), hvilket bekræfter, at de observerede virkninger på specifikke aminosyresubstitutioner er uafhængige af den anvendte type nukleotid-co-substrat.Dernæst testede vi den mulige indvirkning af disse nsp12-substitutioner på replikationen af coronavirus i cellekultur.Til dette formål brugte vi passende genetisk manipulerede komplementære DNA (cDNA) skabeloner klonet i rekombinant vacciniavirus (23, 24) til at transskribere 5-7 celler.Titrering af infektiøst virusafkom produceret i disse celler viste, at de fleste HCoV-229E NiRAN-mutanter ikke var gennemførlige (figur 3E).En gruppe af ikke-levedygtige virale mutanter inkluderer alternativer, der har vist sig at eliminere eller signifikant reducere NMP-transferaseaktivitet in vitro (K4116A, K4135A, R4178A, D4188A, D4280A, D4283A), men der er to andre alternativer (K4116R, E4145A) % reserveret?Deres in vitro NMPyleringsaktivitet tyder på, at yderligere restriktioner er involveret.Tilsvarende producerede to andre mutationer (R4178K, F4281A), der forårsagede et moderat fald i NiRANs in vitro NMPyleringsaktivitet, levende vira, men disse vira reducerede titere signifikant gennem replikation.I overensstemmelse med in vitro-aktivitetsdataene vist i figur 3D, erstatter fire andre rester, der ikke er bevaret i coronavirus og/eller andre indlejrede vira (K4113A, D4180A, D4197A, D4273A) (8, 16) producerede levedygtige vira. en moderat reduceret titer sammenlignet med vildtypeviruset (figur 3E).
For at undersøge, om NiRAN-medieret NMP-transferaseaktivitet afhænger af det aktive RdRp-domæne, blev de to konserverede Asp-rester involveret i koordineringen af divalente metalioner (11) i RdRp-motiv C erstattet af Ala. Det resulterende protein nsp12_DD4823/4AA bevarer dets nsp9 NMPyleringsaktivitet, hvilket indikerer, at nsp12-medieret in vitro nsp9 NMPyleringsaktivitet ikke kræver polymeraseaktivitet (SI Appendiks, figur S4).
Efter at have etableret den nsp9-specifikke NMP-transferaseaktivitet for nsp12, forsøgte vi at karakterisere NMP-nsp9-adduktet ved massespektrometri (MS).Det komplette proteinmassespektrum af rekombinant HCoV-229E nsp9 viste en top ved 12.045 Da (figur 4A).Tilsætningen af nsp12 ændrede ikke kvaliteten af nsp9, hvilket indikerer, at nsp12 og nsp9 ikke ville danne et stabilt kompleks under de anvendte betingelser (denaturering) (figur 4A).I nærvær af UTP og GTP viste massemålingen af reaktionen indeholdende henholdsvis nsp9 og nsp12, at proteinmassen af UTP bevægede sig 306 Da, og proteinmassen af GTP bevægede sig 345 Da, hvilket indikerer, at hvert nsp9-molekyle binder en UMP eller GMP (Billede 4) C og D).Det spekuleres i, at den energi, der kræves til NiRAN-medieret nsp9 NMPylering, kommer fra NTP-hydrolyse og pyrophosphatfrigivelse.Selvom et 10 gange molært overskud af nsp9 (mål) end nsp12 (enzym) blev brugt i denne reaktion, blev der observeret næsten fuldstændig NMPylering af nsp9, hvilket indikerer, at interaktionen mellem nsp12 og nsp9 er kortvarig, og nsp12 kan NMPylere mere nsp9 in vitro molekyle.
Enkelt NMPylering af nsp9 i nærvær af nsp12 og UTP eller GTP.Vist er det dekonvoluterede komplette proteinmassespektrum af HCoV-229E nsp9 (SI tillæg, tabel S1) (AD).(A) nsp9 alene, (B) nsp9 + nsp12-His6, (C) nsp9 + nsp12-His6 i nærvær af UTP, (D) nsp9 + nsp12-His6 i nærvær af GTP.
For at bestemme nsp9-resterne UMPyleret med nsp12 blev nsp9-UMP spaltet med trypsin.De resulterende peptider blev adskilt ved nano-højtydende væskekromatografi (HPLC) og analyseret ved tandem massespektrometri (MS/MS) online.Dataanalyse ved hjælp af Byonic-softwarepakken (Protein Metrics) viste UMPylering af den N-terminale aminosyre.Dette bekræftes manuelt.Tandemmassespektret af precursor-peptidet [UMP]NNEIMPGK (SI-appendiks, figur S5A) afslørede et fragment ved 421 m/z, hvilket indikerer, at UMP binder til rest 1 af nsp9.
Ved N-terminalen af nsp9 er Asn konserveret blandt medlemmerne af Orthocoronavirinae (SI tillæg, figur S6).Selvom vi mener, at det N-terminale primære amin-nitrogen er den mest sandsynlige acceptor for UMP, besluttede vi at opnå yderligere bevis for NMP-binding ved N-terminalen.Af denne grund blev det ikke-NMPylerede og NMPylerede N-terminale peptid nsp9 renset ved HPLC afledt i nærvær af acetone og natriumcyanoborhydrid.Under disse betingelser kan kun frie primære aminer modificeres med propyl (25).Det N-terminale nsp9-afledte peptid med sekvensen NNEIMPGK indeholder to primære aminer, en ved N-terminalen af Asn og den anden ved sidekæden af Lys ved C-terminalen.Derfor kan propylgrupper indføres i begge ender.De ekstraherede ionkromatogrammer af ikke-NMPylerede peptider er vist i SI-tillægget, figur S5B.Som forventet kan N-terminale og C-terminale (mono)propylerede (SI appendiks, figur S5B, øvre bane) og dipropylerede peptider (SI appendiks, figur S5B, nedre bane) identificeres.Dette mønster ændres ved brug af det NMPylerede N-terminale peptid af nsp9.I dette tilfælde kan kun C-terminale propylerede peptider identificeres, men N-terminale propylerede peptider og dipropylerede peptider identificeres ikke (SI-tillæg, figur S5C), hvilket indikerer, at UMP er blevet overført til den N-terminale primære amin For at forhindre dette gruppe fra at foretage ændringer.
Dernæst erstatter vi (med Ala eller Ser) eller sletter de bevarede rester ved N-terminalen af nsp9 for at definere målspecifikke begrænsninger.Baseret på vores MS-data, der viser, at NiRAN danner et nsp9-NMP-addukt med den primære amin af den N-terminale rest af nsp9, antog vi, at nsp9 NMPylering kræver, at den virale masterprotease (Mpro, nsp5) frigiver nsp9 N-terminalen fra dets polyprotein-precursor.For at teste denne hypotese producerede vi et precursorprotein nsp7-11 indeholdende nsp9 i E. coli og udførte en standard NMPyleringstest i nærværelse af [α-32P] UTP (materialer og metoder).Som vist i figur 5A (bane 3) er den uklippede nsp7-11-precursor ikke radiomærket med nsp12.I modsætning hertil, hvis nsp7-11 spaltes af rekombinant nsp5 for at frigive nsp9 (og andre nsps) fra precursoren, påvises et radiomærket protein, der migrerer med nsp9, hvilket bekræfter vores konklusion om, at NiRAN og N-selektiv dannelse af kovalente nsp9-NMP-addukter .Den terminale primære amin af den N-terminale Asn (position 3825 i pp1a/pp1ab).Denne konklusion understøttes også af eksperimenter med nsp9-konstruktionen, som indeholder en eller to yderligere rester ved N-terminalen.I begge tilfælde blev NiRAN-medieret UMPylering af nsp9 afskaffet (SI-tillæg, figur S7).Dernæst producerede vi et protein med en eller to Asn-rester deleteret fra 3825-NNEIMPK-3832-peptidsekvensen ved N-terminalen af nsp9.I begge tilfælde var nsp9 UMPylering fuldstændig blokeret (figur 5B), hvilket giver yderligere bevis for, at den rigtige nsp9 N-terminus fungerer som en NMP-receptor.
Den proteolytiske behandling af nsp9 og rollen af N-terminale rester i nsp12-medieret UMPylering.(A) nsp9 UMPylering kræver en fri nsp9 N-terminal.Nsp7-11-His6 præ-inkuberes ved 30 °C i NMPyleringsdetektionsbuffer indeholdende UTP i nærvær eller fravær af rekombinant Mpro (nsp5-His6).Efter 3 timer startes NMPyleringsassayet ved at tilføje nsp12-His6 som beskrevet i Materialer og metoder.Reaktionen indeholdende nsp5-His6 (bane 1) og nsp9-His6 (bane 2) blev anvendt som kontrol.Efter 10 minutter blev reaktionen afsluttet, og reaktionsblandingen blev adskilt ved SDS-PAGE.Proteinet blev farvet med Coomassie Brilliant Blue (A, øverst).Nsp7-11-His6-precursoren og det forarbejdede produkt, der stammer fra nsp5-His6-medieret spaltning, er vist til højre.Bemærk venligst (på grund af deres lille størrelse), at nsp7 og nsp11-His6 ikke kan påvises i denne gel, og reaktionen er suppleret med nsp5-His6 (bane 1 og 4; positionen af nsp5-His6 er angivet med en udtrukket cirkel) eller nsp9-His6 (bane 2) indeholder en lille mængde MBP (angivet med åbne cirkler) som resterende urenheder, fordi de udtrykkes som MBP-fusionsproteiner (SI-tillæg, tabel S1).(B) Nsp9-His6-varianten mangler en eller to N-terminale Asn-rester (restnummerering i henhold til positionen i pp1a/pp1ab) og er oprenset og inkuberet med nsp12-His6 og [α-32P] UTP.B, SDS-PAGE farvet med Coomassie er vist øverst, B, den tilsvarende autoradiograf er vist nederst.Molekylvægtmarkørens position (i kilodalton) er vist til venstre.(C) HCoV-229E nsp9-His6 N-terminale konserverede rester blev erstattet med Ala eller Ser, og den samme mængde protein blev anvendt i den nsp12-His6-medierede UMPyleringsreaktion.Reaktionsprodukterne blev adskilt ved SDS-PAGE og farvet med Coomassie Brilliant Blue (C, øverst), og radiomærket nsp9-His6 blev detekteret ved phosphorescensbilleddannelse (C, midten).Ved at bruge vildtype (wt) protein som reference (sat til 100%) blev den relative NMPyleringsaktivitet (middel ± SEM) beregnet ud fra tre uafhængige eksperimenter.(D) Virustitre i pl-cellekultursupernatanten af Huh-7-celler inficeret med HCoV-229E vildtype Huh-7-celler og mutanter, der bærer udpegede aminosyresubstitutioner i nsp9, blev bestemt ved plakassay.Den replikationsdeficiente RdRp-motiv C dobbeltmutant DD4823/4AA blev brugt som en negativ kontrol.
N-terminalen af nsp9 (især position 1, 2, 3 og 6) er meget konserveret blandt medlemmer af Orthocoronavirinae-underfamilien (SI-tillæg, figur S6).For at studere den mulige rolle af disse rester i nsp12-medieret nsp9 NMPylering blev to på hinanden følgende Asn-rester ved N-terminalen af nsp9 erstattet med Ala eller Ser (alene eller i kombination).Sammenlignet med vildtype nsp9 resulterede udskiftning af N3825 med Ala eller Ser i mere end en to gange reduktion i nsp12-medieret UMPylering (figur 5C).I overensstemmelse med vores konklusion om, at NMPylering forekommer ved den N-terminale primære amin i stedet for sidekæden af den N-terminale rest, observerede vi signifikant resterende NMPylering med udskiftning af N3825A og N3825S.Interessant nok, hvis den anden Asn erstattes af Ala eller Ser, reduceres nsp9 UMPylering kraftigere (mere end 10 gange), mens udskiftningen af Ala i positionerne 3, 4 og 6 kun har en moderat effekt på nsp9 UMPylering (Figur 2) ).5C).Lignende resultater blev opnået ved brug af ATP, CTP eller GTP (SI-tillæg, figur S8).Samlet indikerer disse data nøglerollen for N2826 (position 2 i nsp9) i nsp9 NMPylering.
For at opnå yderligere bevis for den funktionelle korrelation mellem N-terminalen af nsp9 og NMPylering udførte vi en multipel sekvensjustering (MSA) af nsp9-sekvensen af Coronavirus-familien (varierende mellem 104 og 113 rester) (SI-tillæg, figur S6).I alt i 47 (kendte og formodede) arter af 5 slægter af Orthocoronavirinae-underfamilien, der inficerer forskellige pattedyr, fugle og krybdyrværter, blev kun 8 rester i alt fundet at være invariante.De mest omfattende ændringer, inklusive deletioner og insertioner, blev observeret i cyklusserne mellem de sekundære strukturelementer af nsp9, som bestemt af tidligere strukturelle undersøgelser (26 ??28).Fem invariante rester blev fundet i β-strengen og α-helixen af den C-terminale del af nsp9.Tre invariante rester udgør NNE-motivet af N-terminalen af nsp9.Det afsløres, at den anden Asn af dette motiv er den eneste invariante rest, som også deles af den hypotetiske nsp9 af den fjernt beslægtede frø-coronavirus, og repræsenterer Microhyla letovirus 1-arten i underfamilien Letovirinae af Alphaletovirus.Bevarelsen af rester i nsp9 sekundære strukturelementer kan rationaliseres af strukturelle overvejelser for at opretholde foldning eller kendte RNA-bindingsegenskaber.Dette ræsonnement ser dog ikke ud til at gælde for bevarelsen af NNE, og forud for denne undersøgelse var arten af de begrænsninger, der begrænser variationen af tripeptidsekvensen, fuldstændig tilsløret.
For at bestemme vigtigheden af nsp9-NMPylering og NNE-konservering i coronavirus-replikation producerede vi HCoV-229E-mutanter, som bærer enkelte eller dobbelte substitutioner af nsp9 N-terminale rester, hvilket indikerer, at nsp9 NMPylering er skadelig in vitro.Før vi starter, forsøger vi at besvare spørgsmålet, om disse substitutioner (nær nsp8|9-spaltningsstedet) påvirker den proteolytiske behandling af den C-terminale pp1a-region.Et sæt nsp7-11 polyproteinkonstruktioner indeholdende tilsvarende substitutioner ved N-terminalen af nsp9 blev produceret i E. coli og skåret med rekombinant Mpro.Den proteolytiske spaltning af de fire steder (inklusive det nsp9-flankerende sted) er ikke signifikant påvirket af nogen indførte substitutioner (SI-tillæg, figur S9), eksklusive strukturelle ændringer i disse proteiner, der interfererer med Mpro-medieret nsp8|9-spaltning (eller andet) internet side.
Huh-7-celler blev transficeret med genomlængde HCoV-229E RNA, der koder for Ala- eller Ser-substitutioner i de konserverede NNE-tripeptider (N3825, N3826 og E3827) ved nsp9 N-terminalen, hvilket viser, at de fleste af mutationerne er dødelige.Vi var i stand til at redde virussen ved at erstatte Ser eller Ala af den N-terminale Asn (N2835A eller N2835S), men det lykkedes ikke at genvinde virussen med andre enkelt- og dobbeltmutationer i NNE-sekvensen (N3826A, N3826S, NN3825/6AA, NN3825/6SS), E3827A) (Figur 5D).
Disse resultater indikerer, at replikationen af coronavirus i vævskultur er begrænset (samme eller lignende), hvilket begrænser den naturlige mutation af nsp9 NMPyleringssteder i kroppen og understøtter nøglerollen for dette respons i coronaviruss livscyklus.
I det sidste sæt af eksperimenter producerede vi C-terminal His6 mærket SARS-CoV-2 nsp12 og nsp9 og to mutante former af nsp12 i E. coli.De aktive site-rester i NiRAN- og RdRp-domænerne blev henholdsvis Brug Ala i stedet for (Figur 6A og SI-tillæg, Tabel S2).K4465 i SARS-CoV-2 nsp12 svarer til K4135 i HCoV-229E (SI-tillæg, figur S2), som viste sig at være påkrævet til NiRAN-aktivitet og HCoV-229E-replikation (figur 3D og E).Denne rest svarer også til den arterielle virus EAV nsp9 K94 rest, som tidligere har vist sig at være nødvendig for NiRAN selv-UMPylering/selv-GMPylering (16).Som vist i figur 6B har SARS-CoV-2 nsp12 UMP-transferaseaktivitet under anvendelse af nsp9 som et substrat, mens nsp12_K4465A-aktivstedsmutanten er inaktiv.Den dobbelte substitution i den karakteristiske SDD-sekvens af RdRp-motiv C påvirker ikke UMP-transferaseaktivitet (figur 6B), hvilket indikerer, at RdRp-aktivitet ikke har nogen direkte virkning i nsp9 UMPylering.Lignende data blev opnået ved hjælp af CTP, GTP og ATP (SI-tillæg, figur S10).Sammenfattende indikerer disse data, at NiRAN-medieret nsp9 NMPylering har en konservativ aktivitet i coronavirus, der repræsenterer forskellige slægter af orthocoronavirus-underfamilien.
SARS-CoV-2 nsp12-medieret NMPylering af nsp9.(A) Coomassie-farvet SDS-polyacrylamidgel, der viser det rekombinante protein, der blev brugt i NMPyleringstesten.Som kontrol blev der anvendt et mutantprotein med substitution af aktivt sted i NiRAN-domænet (K4465A) og RdRp-domænet (DD5152/3AA) af SARS-CoV-2 nsp12.Restnummerering er baseret på position i pp1ab.(B) Autoradiograf af UMPyleringsdetektion under anvendelse af nsp9-His6 og [α-32P]UTP som substrat for nsp12-His6 (vildtype [wt] og mutant).Molekylmassen (i kilodaltons) af det mærkede protein er vist til venstre.
NiRAN-domæner er generelt konserverede i Nidovirales (16), hvilket indikerer, at de katalyserer enzymatiske reaktioner, der er essentielle for Nidovirus-replikation.I denne undersøgelse var vi i stand til at bevise, at NiRAN-domænet af coronavirus overfører NMP (genereret fra NTP) til nsp9, et mystisk RNA-bindende protein involveret i virusreplikation (26 ?? 29 ), for at bestemme det som et naturligt mål og partner til coronavirus RTC.
NiRAN-domænet deler tre sekvensmotiver (AN, BN og CN), som indeholder et meget lille antal rester, der er konserveret i alle familier i den monofyletiske, men stærkt differentierede Nidovirales-rækkefølge (8, 16).Nylige undersøgelser har vist, at de er strukturelt relateret til en stort set ukarakteriseret familie af proteinkinase-lignende proteiner, som oprindeligt blev kaldt SelO-familien (17, 19, 22, 30, 31).SelO-relaterede proteiner har kinasefolder, men mangler adskillige konserverede rester af det aktive sted i klassiske kinaser (22, 32).Baseret på den omvendte orientering af ATP-molekyler bundet til det aktive sted og stabiliseret ved specifikke interaktioner, blev SelO antaget og efterfølgende bekræftet at overføre AMP (i stedet for fosfat) til proteinsubstratet (22), mens et andet bakterielt SelO-lignende protein YdiU har for nylig vist sig at katalysere den kovalente binding af UMP til Tyr og His-rester af forskellige proteinsubstrater (33).
For at bekræfte og udvide forudsigelsen af de formodede rester af det aktive sted af coronavirus NiRAN-domænet brugte vi biokemiske og omvendt genetikmetoder til at udføre mutationsanalyse på coronavirus nsp12 (Figur 3D og E og SI tillæg, figur S3 og tabel) S1â S4).Dataene viser, at udskiftningen af HCoV-229E K4135, R4178 og D4280 med Ala eliminerer in vitro NMP-transferaseaktivitet og virusreplikation i cellekultur (figur 3D og E og SI bilag, figur S3), hvilket understøtter deres tilstedeværelse i NTP γ-phosphat (K4135, R4178) og koordineringen af metalioner på det aktive sted (D4280).E4145A-substitutionen af den konserverede Glu i området for fuglerede virus, der forudsagdes at stabilisere K4135 (17) positionen, blev vist at eliminere viral replikation, men overraskende nok blev aktiviteten bibeholdt i in vitro NMPyleringsassayet (Figur 3D og E og SI-tillæg, figur S3 og tabeller S1-S4).En lignende observation blev gjort, da den tilsvarende substitution blev indført i YdiU-homologen af Salmonella typhimurium (E130A) (33).Tilsammen understøtter disse data den regulatoriske funktion af denne konserverede rest snarere end den katalytiske funktion.
Udskiftning af den konserverede Phe-rest (F4281A) inden for nestovirusområdet i HCoV-229E NiRAN-domænet (8) resulterede i et fald i NMPyleringsaktivitet in vitro og et signifikant fald i virusreplikation i cellekultur (figur 3D, E og SI) bilag, figur S3).Dataene er i overensstemmelse med den vigtige regulatoriske funktion af denne rest, såsom den homologe DFG-motiv Phe-rest vist tidligere.I klassiske proteinkinaser er det en del af Mg2+ bindingsløkken og hjælper med at samle og regulere rygsøjlen???Nødvendig for effektiv katalytisk aktivitet (32, 34).Substitution af Ala og Arg for K4116-rester (i preAN-motivet), eliminerede henholdsvis viral replikation og havde som forventet forskellige virkninger på NMP-transferaseaktivitet in vitro, afhængigt af den introducerede aminosyresidekæde (Figur 3D og E og SI appendikser) , figur S3).De funktionelle data er i overensstemmelse med de strukturelle oplysninger, hvilket indikerer, at denne rest har etableret en interaktion med ATP-phosphat (17).I NiRAN-domænet af andre indlejrede virusfamilier er positionen af HCoV-229E pp1a/pp1ab K4116 besat af Lys, Arg eller His (8), hvilket indikerer, at den funktionelle begrænsning af denne specifikke rest er blevet lempet.Substitutionen af D4188A og D4283A eliminerer eller reducerer kraftigt enzymaktivitet og eliminerer virusreplikation (figur 3).Disse to rester er konserveret i de fleste (men ikke alle) indlejrede vira (8), hvilket indikerer en vigtig familiespecifik, men muligvis ikke-katalytisk funktion.Ala-substitutioner af adskillige andre Lys- og Asp-rester (K4113A, D4180A, D4197A og D4273A), som ikke er konserverede i Coronaviridae- eller andre Nestioviridae-familier (8), blev anvendt som kontroller.Som forventet er disse substitutioner stort set tolerable med et lille fald i enzymaktivitet og viral replikation i nogle tilfælde (figur 3 og SI-tillæg, figur S3).Samlet set er corona-mutagenesedataene meget konsistente med selv-GMP og omvendt genetikdata for EAV NiRAN-RdRp (16), hvor EAV nsp9 (coronavirus nsp12 ortholog) rest K94 (svarende til HCoV-229E K4135) er vigtige funktioner), R124 (svarende til R4178), D132 (svarende til D4188), D165 (svarende til D4280), F166 (svarende til F4281).Derudover er HCoV-229E-mutagenesedataene i overensstemmelse med og udvidet fra de tidligere rapporterede SARS-CoV omvendte genetikdata (16), lige så meget lig dem, der er observeret for det tilsvarende CN-motiv Phe-to-Ala mutant SARS-CoV_nsp12. fænotype beskrevet -F219A og HCoV-229E_F4281A (figur 3 D og E og SI tillæg, figur S3 og tabel S1-S4).
Sammenlignet med EAV-ortologer (16), som har en klar præference for UTP og GTP (i selv-NMPyleringsreaktionen), viser vores undersøgelse, at coronavirus NiRAN-domænet (repræsenteret af HCoV-229E og SARS-CoV-2) kan være effektivt overført Alle fire NMP'er, selvom der er en lille præference for UMP (figur 1 og 3).Den relativt lave specificitet af det specifikke NTP-co-substrat er i overensstemmelse med den nyligt rapporterede SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13 superkompositstruktur, hvor ADP-Mg2+ binder til det aktive sted i NiRAN, men ikke med adenin-delen af dannelsen af specifikke interaktioner (17).I vores undersøgelse har den type nukleotid, der anvendes i NMPyleringsreaktionen, ingen differentiel effekt på aktiviteten af mutantproteinet (SI-tillæg, figur S3), hvilket indikerer, at ingen af disse rester er tæt forbundet med bindingen af en specifik nukleobase.Det strukturelle grundlag og den potentielle biologiske betydning af de forskellige NTP-co-substratpræferencer observeret i NiRAN-domænerne af coronavirus og arterielle vira mangler at blive undersøgt;de kan være sande eller kan skyldes begrænsningerne i deres respektive studier.På nuværende tidspunkt kan det ikke udelukkes, at den potentielle NMPylator-aktivitet af det arterielle virus NiRAN-domæne (sammenlignet med den tidligere karakteriserede selv-NMPyleringsaktivitet) har en anden co-substratpræference, idet der tages højde for, at ligheden mellem den arterielle og coronavirussen NiRAN-domænet er på sin grænse.Sekvensbaseret sammenligning (16).Sammenlignet med pseudokinasen SelO, der bruger Mg2+ som en cofaktor, er aktiviteten af coronavirus og arteriel virus NiRAN afhængig af Mn2+ (16) (Figur 3C og SI tillæg, Figur S1).Mn2+-afhængigheden og den åbenlyse præference for UTP er et usædvanligt træk ved protein-NMPylatorer og er først for nylig blevet bekræftet i YdiU-proteinet fra Salmonella typhimurium, som katalyserer den strenge Mn2+-afhængige proteinchaperon UMPylering for at beskytte celler mod stressinduktion Celle ATP-pulje ( 33).
Den nyligt beskrevne strukturelle lighed mellem coronavirus NiRAN-domænet og cellulære proteinkinaser (17, 19) giver yderligere støtte til NiRANs evne til kovalent at forbinde NMP til andre proteiner, vi har rapporteret i denne undersøgelse.Vi fokuserede vores søgen efter mulige NiRAN-mål på proteinerne kodet af HCoV-229E ORF1a, som vides at direkte eller indirekte assistere RTC's ORF1b-kodede replikase (12, 35).Vores eksperimenter giver afgørende bevis for den effektive og specifikke NMPylering af nsp9 (figur 2).Hvis målproteinet anvendes i et molært overskud, der er 8 til 10 gange højere end enzymets (nsp12), bekræftes det, at nsp9 er fuldstændig (mono)NMPiseret (figur 4).Vi konkluderede, at interaktionen mellem nsp12 og nsp9 er kortvarig og ikke vil danne et stabilt kompleks med nsp9 (i fravær af andre RTC-underenheder).Denne konklusion understøttes af proteininteraktionsundersøgelser på SARS-CoV-proteomet (35).MS-analyse identificerede den primære amin af den N-terminale rest af nsp9 som NMPyleringsstedet (SI-tillæg, figur S5).Dannelsen af phosphoramidatbindingen og den N-terminale aminogruppe adskiller den NiRAN-medierede NMPyleringsaktivitet fra den Pseudomonas syringae SelO-medierede AMPyleringsreaktion, som katalyserer dannelsen af O-bundet AMP ved Ser-, Thr- eller Tyr-rester Peptidaddukt ( 22), og S. typhimurium YdiU danner O-bundne (med Tyr) og N-bundne (med His) peptid-UMP-addukter.Den begrænsede information, der er tilgængelig om SelO-familien af proteiner, indikerer, at medlemmer af denne store proteinfamilie adskiller sig meget i dannelsen af peptid-NMP-addukter.Dette er en interessant observation, som fortjener yderligere undersøgelse.
Dataene opnået i denne undersøgelse førte os til at antage, at NMPyleringen af nsp9 kræver en fri N-terminal.I forbindelse med viral replikation vil dette blive tilvejebragt af den proteolytiske spaltning af nsp8|nsp9-behandlingsstedet i replikasepolyproteinet pp1a medieret af Mpro og pp1ab.I de fleste coronavirus er forskellen mellem dette specifikke sted (VKLQ|NNEI i HCoV-229E) og alle andre coronavirus Mpro-spaltningssteder, at Asn (i stedet for en anden lille rest, såsom Ala, Ser eller Gly) optager P1â???Sted (36).Peptidspaltningsdataene opnået i de tidlige undersøgelser viste, at spaltningseffektiviteten af nsp8|nsp9-stedet var lavere end for andre steder, hvilket indikerer, at 1) dette specifikke sted kan have en regulerende rolle i den rettidige koordinerede behandling af C-terminalen pp1a-region, eller 2) a Rollen af den specielle konserverede nsp9 N-terminal i virusreplikation (37).Vores data (figur 5A) viste, at den rekombinante form af nsp9, der bærer den rigtige N-terminale sekvens, effektivt blev NMPiseret af nsp12.Den N-terminale flankerende sekvens blev fjernet med faktor Xa (nsp9-His6; SI-tillæg, tabel S1) eller Mpro-medieret spaltning (nsp7-11-His6; figur 5A og SI-tillæg, tabel S1).Det er vigtigt, at den uklippede nsp9-holdige precursor nsp7-11-His6 viste resistens over for NMPylering af nsp12, hvilket er i overensstemmelse med vores data, hvilket indikerer, at nsp9-NMP-adduktet dannes gennem den N-terminale primære amin (SI appendiks, figur S5) .For at få en dybere forståelse af NiRAN-substratspecificitet fokuserede vi derefter på de tilstødende N-terminale rester af nsp9.I fravær af andre proteiner er de strukturelt fleksible, hvilket forhindrer dem i at blive påvist i den umærkede form af nsp9 (26 28, 38), hvilket indikerer deres begrænsede naturlige variation. Dette skyldes den vigtige sekvensspecifikke (ikke sekundær strukturrelateret) funktion af det nsp9 N-terminale fragment.Ala-substitutioner af konserverede rester i denne region (figur 5C og D og SI-appendiks, figur S8) afslører, at N3826 er essentiel for nsp9 NMPylering in vitro, mens N3825A og E3827A substitutioner fører til et fald i NMPylering, mens M3829A og P3830A substitutioner ikke gør det .Naturligvis påvirke nsp9 NMPylering.Selvom substitutionen af N-terminal Asn (N3825A, N3825S) kun har en moderat effekt på nsp9 NMPylering og virusreplikation i cellekultur (figur 5C og D), er deletionen af en Asn-restsekvens fra det N-terminale 3825-NN-dipeptid viste sig at være Det er dødelig for vira, hvilket indikerer, at en Asn-rest er påkrævet før en anden rest ved N-terminalen, fortrinsvis Asn, selvom det ser ud til, at substitution af lignende rester delvist kan tolereres (figur 5B, C og D).Vi konkluderer, at 3825-NN-dipeptidet, især den konserverede og essentielle N3826-rest inden for coronavirus-området (SI-appendiks, figur S6), sikrer den korrekte binding og orientering af nsp9 N-terminalen i det aktive sted af NiRAN.
At erstatte Ala (E3827A) med den konserverede Glu fra alle underfamilier bevarer nsp9 NMPylering in vitro, men er dødelig for vira i cellekultur (figur 5C og D), hvilket indikerer den yderligere funktion af denne rest, for eksempel i nøgleinteraktioner (NMPyleret eller umodificeret) ) nsp9 N-terminal og andre faktorer involveret i virusreplikation.Nsp9-mutationer påvirkede ikke den proteolytiske proces af nsp9 eller nogen tilstødende nsps (39) (SI-tillæg, figur S9), hvilket indikerer, at de dødelige fænotyper af flere observerede nsp9-mutationer ikke var forårsaget af dysreguleringen af det C-proteolytiske procesterminale pp1a-område .
Ovenstående data giver bevis for, at efter Mpro-medieret behandling af nsp8|9-spaltningsstedet i pp1a/pp1ab, kan N-terminalen af nsp9 UMPyleres (eller delvist modificeres med en anden NMP).Derudover førte den fremragende bevarelse af N-terminalen af nsp9 (inklusive de entydige og invariante Asn-rester i coronavirus-familien) og de omvendte genetiske data opnået i denne undersøgelse (figur 3E og 5D) os til at konkludere, at den beskrevne nsp9 NMPylering er biologisk relateret og afgørende for replikation af coronavirus.De funktionelle konsekvenser af denne modifikation mangler at blive undersøgt, for eksempel med hensyn til den tidligere beskrevne (ikke-specifikke) nsp9 (umodificeret form) RNA-bindingsaktivitet (2628).N-terminal NMPylering kan også påvirke interaktionen af nsp9 med protein- eller RNA-substrater eller dannelsen af forskellige fire-niveau samlinger.Disse er blevet observeret i strukturelle undersøgelser og er blevet bekræftet at være funktionelt relateret til coronavirus-replikation, dog især i fravær af I tilfælde af denne modifikation (26- âââ29, 40).
Selvom målspecificiteten af coronavirus NiRAN-domænet stadig skal karakteriseres mere detaljeret, viser vores data, at proteinmålspecificiteten for coronavirus NiRAN-domænet er meget snæver.Selvom konserveringen af nøgleaktive site-rester (8, 16) i NiRAN-domænet af alle nidovirus-familier stærkt understøtter aktiviteten af den konserverede NMPylator disse proteiner, er identiteten af de substratbindende lommerester i dette domæne endnu ikke karakteriseret Konservering og konservering , og kan variere mellem forskellige familier af Nidovirales-formål.Tilsvarende er de relevante mål for andre indlejrede vira endnu ikke fastlagt.De kan være fjerntliggende ortologer af nsp9 eller andre proteiner, fordi sekvenserne uden for de fem replikasedomæner, der generelt er konserverede i indlejrede vira, er mindre konserverede (8), inklusive genom-arrayet mellem Mpro og NiRAN. Blandt dem er nsp9 placeret i coronavirus.
Derudover kan vi i øjeblikket ikke udelukke muligheden for, at NiRAN-domænet har yderligere (inklusive cellulære) mål.I dette tilfælde er det værd at nævne, at bakteriehomologerne i dette nye protein NMPylatorer (NMPylatorer) (30, 31) ser ud til at have "masterregulatorer"?NMP modulerer en række cellulære proteiner for at regulere eller eliminere deres downstream-aktiviteter og spiller derved en rolle i en række biologiske processer, såsom cellulær stressrespons og redox-homeostase (22, 33).
I denne undersøgelse (figur 2 og 4 og SI-tillæg, figur S3 og S5) var vi i stand til at bevise, at nsp12 overførte UMP (NMP)-delen til en enkelt (konserveret) position i nsp9, mens andre proteiner ikke blev modificeret i anvendt Under betingelserne understøttes veldefineret (i stedet for løs) substratspecificitet.I overensstemmelse med dette, sammenlignet med N-terminal nsp9 NMPylering, er nsp12's egen NMPyleringsaktivitet meget lav, dets påvisning kræver længere autoradiografi eksponeringstid, og en 10 gange stigning i nsp12 koncentration anvendes.Derudover formåede vores MS-analyse ikke at give bevis for NMPylering af nsp12, hvilket tyder på, at NiRAN-domænets selv-NMPylering (i bedste fald) er en sekundær aktivitet.Det skal dog bemærkes, at andre undersøgelser har givet foreløbige beviser for, at selv-AMPyleringsstatus for bakteriel NMPylator kan kontrollere deres NMPyleringsaktivitet på andre proteinsubstrater (22, 33).Derfor er der behov for mere forskning for at undersøge de mulige funktionelle effekter af selv-NMPyleringsaktiviteter rapporteret for EAV nsp9 (16) og coronavirus nsp12 (denne undersøgelse), herunder den foreslåede chaperone-lignende effekt på foldningen af det C-terminale RdRp-domæne ( 16)).
Tidligere er flere hypoteser vedrørende de mulige downstream-funktioner af det nidovirale NiRAN-domæne blevet overvejet, herunder RNA-ligase, RNA-capped guanylate transferase og protein priming-aktivitet (16), men ingen af dem er kompatible med de tilgængelige downstream-funktioner.Oplysningerne opnået i de følgende positioner er nøjagtigt på samme tid uden yderligere antagelser.Dataene opnået i denne undersøgelse er mest i overensstemmelse med (men kan ikke bevise), at NiRAN-domænet er involveret i initieringen af protein-induceret RNA-syntese.Det blev tidligere antaget, at funktionen af NiRAN-domænet i 5??²-RNA capping eller RNA-ligeringsreaktioner påvirkes ikke af disse og understøttelse af andre data.Derfor anses det aktive sted for NiRAN for eksempel for at involvere den konserverede Asp som en generel base (D252 i Pseudomonas syringae SelO; D4271 i HCoV-229E pp1ab; D208 i SARS-CoV-2 nsp12) (SI Appendiks, figur 2) ).S2) (17, 22, 33), mens katalysen i den ATP-afhængige RNA-ligase og RNA-capping-enzymet udføres af det kovalente enzym-(lysyl-N)-NMP-mellemprodukt, som involverer en ikke-ændret Lys-rest ( 41).Derudover modsætter den bemærkelsesværdige sekvensbaserede specificitet af coronavirus NiRAN for konserverede proteinmål og den afslappede specificitet for NTP-co-substrater (foretrækker UTP) NiRAN-medieret capping-enzym eller RNA-ligase-lignende funktioner.
Det er klart, at der er behov for en masse ekstra arbejde for at verificere og, hvis bevist, uddybe den mulige rolle af nsp9-UMP (nsp9-NMP) i protein-induceret RNA-syntese, hvilket vil forbinde flere interessante, men (indtil videre) rapporter tidligere rapporteret .Isolerede observationer.For eksempel er det blevet bestemt, at enden af den negative streng-RNA af coronavirus starter med en oligo(U)-streng (42, 43).Denne observation stemmer overens med ideen om, at syntesen af negativ-streng RNA initieres ved at binde den UMPylerede form af nsp9 til poly(A) halen (triggere), som kan fremmes af dens RNA-binding. Aktiviteten og/eller interaktionen med et andet RTC-protein.UMP-delen leveret af nsp9 kan derefter bruges som en "primer" til nsp7/8/nsp12-medieret oligouridylering ved at bruge 3??²-poly(A) halen i det genomiske RNA eller en anden oligo (A)-holdig sekvens tjener som en skabelon, svarende til mekanismen etableret for picornavirus VPg-proteinet (44).Hvad hvis forslaget er "ikke-normativt"????Starten af den (protein-inducerede) negativ-streng RNA-syntese giver et link til observationerne, hvilket indikerer, at coronavirus-negativ-streng RNA'et har UMP (i stedet for UTP) i sin ende (42), hvilket anses for at indikere, at nukleinsyre Dicer spalter enden phosphoryleret af en ukendt uridin-specifik endonuklease.Hvis bekræftet, kan denne nukleinsyrehydrolytiske aktivitet hjælpe med at frigive den oligomere UMPylerede form af nsp9 fra den 5 ² ende af den begyndende negative streng.Den mulige rolle af nsp9 i protein priming er også i overensstemmelse med tidligere undersøgelser af omvendt genetik, som har vist, at nsp9 (og nsp8) interagerer kritisk og specifikt med det konserverede cis-virkende RNA-element nær 3-enden af coronavirus-genomet.45).Ifølge denne rapport kan disse tidligere observationer nu genovervejes og udvides gennem yderligere forskning.
Sammenfattende bestemte vores data den specifikke aktivitet af et proprietært indlejret virusenzymmærke knyttet til RdRp ved N-terminalen.I coronavirus bruges denne nyopdagede NiRAN-medierede UMPylator/NMPylator-aktivitet til at stole på Mn2+ og tilstødende Asn-rester og forårsage dannelsen af (lavenergi) phosphoramidatbindinger med den N-terminale primære amin.Gennem Mpro-medieret spaltning ved nsp8|9-spaltningsstedet kan nsp9-målet bruges til NMPylering, hvilket indikerer den funktionelle kobling mellem proteasen og NiRAN-domænet, som strækker sig til RdRp.Bevarelsen af nøglerester i det aktive nsp12 NiRAN-sted og nsp9-målet, kombineret med data opnået fra to coronavirusser, herunder SARS-CoV-2, giver stærke beviser for, at nsp9 NMPylering er et coronavirus. Konservative egenskaber er også et nøgletrin i virusreplikation.De tilgængelige data fører os til at konkludere, at den specifikke rolle af NMPyleret form af nsp9 i protein-induceret RNA-syntese er et rimeligt scenarie for coronavirus og andre indlejrede vira, og NiRAN kan også målrette mod andre uidentificerede proteiner.Reguler virussen.Værtsinteraktion.Hvis det bekræftes, vil involveringen af proteinprimere i viral RNA-syntese øge sekvensaffiniteten af Mpro/3CLpro- og RdRp-domænerne mellem den tidligere påviste coronavirus og picornavirus-lignende supergruppe (9), som nu er blevet forenet i de nyligt etablerede Pisonivirites ( 46) i kategorien.
Vores data viser også, at de grundlæggende, selektive og konservative enzymaktiviteter identificeret i denne undersøgelse kan bruges som mål for antivirale lægemidler.Forbindelser, der interfererer med bindingen (og efterfølgende modifikation) af den konserverede nsp9 N-terminus i det aktive sted af NiRAN, kan udvikles til effektive og alsidige antivirale lægemidler, der er velegnede til behandling af animalske og humane coronavirusser fra forskellige (under)slægtsinfektioner , herunder SARS-CoV-2 og Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus.
Den kodende sekvens af coronavirus-proteinet produceret i denne undersøgelse blev amplificeret ved RT-PCR under anvendelse af RNA isoleret fra Huh-7 inficeret med HCoV-229E eller Vero E6 inficeret med SARS-CoV-2 og indsat ved anvendelse af standardkloningsprocedurer.pMAL-c2 (New England Biological Laboratory) eller pASK3-Ub-CHis6 (47) ekspressionsvektor (SI-tillæg, tabel S1 og S2).Enkeltkodonsubstitutioner blev indført ved PCR-baseret stedstyret mutagenese (48).For at producere MBP-fusionsproteinet blev E. coli TB1-celler transformeret med den passende pMAL-c2-plasmidkonstruktion (SI-appendiks, tabel S1).Fusionsproteinet blev oprenset ved amyloseaffinitetschromatografi og spaltet med faktor Xa.Efterfølgende blev det C-terminale His6-mærkede protein oprenset ved Ni-immobiliseret metalaffinitetskromatografi (Ni-IMAC) som tidligere beskrevet (49).For at producere ubiquitin-fusionsproteinet brugte E. coli TB1-celler den passende pASK3-Ub-CHis6-plasmidkonstruktion (SI-tillæg, tabel S1 og S2) og pCGI-plasmid-DNA, der koder for ubiquitin-specifik C-terminal hydrolase 1 (Ubp1).Transformation (47).Det C-terminale His6-mærkede coronavirus-protein blev oprenset som tidligere beskrevet (50).
Selv-NMPyleringstesten af HCoV-229E nsp12-His6 blev udført som beskrevet i EAV nsp9 (16).Kort fortalt indeholder nsp12-His6 (0,5 µM) 50 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinethansulfonsyre (HEPES)-KOH, pH 8,0, 5 mM dithiothreitol (DTT), 6 mM MnCl2, 25 µM buffer, 25 µM buffer. den specificerede NTP og 0,17 µM matchede [α32-P]NTP (3.000 Ci/mmol; Hartmann Analytic) ved 30 °C i 30 minutter.I alle andre (standard) NMPyleringsassays af nsp12-medieret nsp9 NMPylering justeres reaktionsbetingelserne som følger: nsp12-His6 (0,05 µM) og nsp9-His6 (4 µM) i nærvær af 50 mM HEPES-KOH (pH 8). ), 5 mM DTT, 1 mM MnCl2, 25 µM indikerede NTP og 0,17 µM matchede [a32-P]NTP.Efter inkubation i 10 minutter ved 30°C blev reaktionsprøven blandet med SDS-PAGE prøvebuffer: 62,5 mM tris(hydroxymethyl)aminomethan HCI (pH 6,8), 100 mM DTT, 2,5 % SDS, 10 % glycerol og 0,005 % bromphenol blå.Proteinet blev denatureret ved opvarmning ved 90°C i 5 minutter og adskilt med 12% SDS-PAGE.Gelen fikseres og farves med Coomassie Brilliant Blue-opløsning (40% methanol, 10% eddikesyre, 0,05% Coomassie Brilliant Blue R-250), affarves og udsættes for en phosphorescerende billedskærm i 20 timer (for at påvise nsp12 fra NMPylering) eller (maksimalt) 2 timer (for at vurdere nsp9 NMPylering).En Typhoon 9200 imager (GE Healthcare) blev brugt til at scanne skærmen og ImageJ blev brugt til at analysere signalintensiteten.
Til MS-analyse blev 1 µM nsp12-His6 og 10 µM nsp9 (uden hexahistidin-tag) brugt i NMPyleringsanalyse (SI-tillæg, tabel S1), og den øgede koncentration af 500 µM UTP og GTP blev brugt.Afhængigt af deres koncentration og forventede proteinkvalitet blev et Waters ACQUITY H-klasse HPLC-system udstyret med en MassPrep-søjle (Waters) brugt til at afsalte 1 til 10 µL bufferede proteinopløsninger online.Det afsaltede protein elueres ind i elektrospray-ionkilden af Synapt G2Si massespektrometer (Waters) gennem følgende gradient af buffer A (vand/0,05 % myresyre) og buffer B (acetonitril/0,045 % myresyre), og kolonnetemperaturen er 60 °C og en flowhastighed på 0,1 ml/min.: eluering isokratisk med 5 % A i 2 minutter, derefter en lineær gradient til 95 % B inden for 8 minutter, og bibehold 95 % B i yderligere 4 minutter.
Positive ioner med et masseområde på 500 til 5000 m/z detekteres.Glu-fibrinopeptid B måles hvert 45. sekund for automatisk massedriftskorrektion.Brug MassLynx instrumentsoftware med MaxEnt1-udvidelse til at dekonvolvere det gennemsnitlige spektrum efter fradrag af baseline og udjævning.
UMPyleret HCoV-229E nsp9 blev fordøjet ved tilsætning af sekventeringsgrad modificeret trypsin (Serva) og inkuberet natten over ved 37 °C.En Chromabond C18WP spin-søjle (delnummer 730522; Macherey-Nagel) blev brugt til at afsalte og koncentrere peptiderne.Til sidst blev peptidet opløst i 25 µL vand, som indeholdt 5 % acetonitril og 0,1 % myresyre.
Prøverne blev analyseret af MS ved anvendelse af et Orbitrap Velos Pro massespektrometer (Thermo Scientific).Det ultimative nanoâ HPLC-system (Dionex), udstyret med en brugerdefineret endemonteret 50 cm??75 μm C18 RP kolonne pakket med 2,4 μm magnetiske perler (Dr. Albin Maisch High Performance LC GmbH) Tilslut til massespektrometeret online gennem Proxeon nanospraykilden;injicer 6 µL trypsinfordøjelsesopløsning i en 300 µm indre diameter ×??1 cm C18 PepMap præ-koncentrationssøjle (Thermo Scientific).Ved at bruge vand/0,05 % myresyre som opløsningsmiddel blev prøven automatisk fanget og afsaltet ved en strømningshastighed på 6 µL/min.
Følgende gradienter af vand/0,05% myresyre (opløsningsmiddel A) og 80% acetonitril/0,045% myresyre (opløsningsmiddel B) blev anvendt til at opnå adskillelse af tryptiske peptider ved en strømningshastighed på 300 nL/min: 4% B for 5 minutter, derefter 30 A lineær gradient til 45 % B inden for minutter og en lineær stigning til 95 % opløsningsmiddel B inden for 5 minutter.Forbind den kromatografiske søjle til en nano-emitter i rustfrit stål (Proxeon), og sprøjt eluenten direkte til massespektrometerets opvarmede kapillar ved brug af et potentiale på 2.300 V. Opmålingsscanningen med en opløsning på 60.000 i Orbitrap-masseanalysatoren er tilknyttet med mindst tre data-MS/MS-scanninger, dynamisk udelukket i 30 sekunder, ved brug af lineær ionfælde-kollisionsinduceret dissociation eller højere energi-kollisionsdissociation kombineret med orbitrap-detektion. Opløsningen er 7.500.
Indlægstid: Aug-03-2021